Pernahkah Kamu bertanya-tanya bagaimana tanaman bisa mengubah sinar matahari menjadi energi? Salah satu kuncinya terletak pada stomata, pori-pori kecil di permukaan daun yang mengatur masuknya karbon dioksida (CO2) untuk fotosintesis. Stomata ini bagaikan gerbang yang membuka dan menutup, dan prosesnya ternyata sangat menarik!

Dalam artikel ini, kita akan membahas peran penting asam 5-aminolevulinat (ALA) dalam membuka stomata, serta bagaimana metabolisme pati di sel penjaga (guard cells) memengaruhi proses ini. Bersiaplah untuk menyelami dunia biokimia tanaman yang menakjubkan!

Apa Itu ALA dan Mengapa Penting untuk Tanaman?

ALA adalah asam amino non-protein yang menjadi prekursor penting untuk biosintesis semua senyawa tetrapirol. Senyawa ini krusial untuk pembentukan klorofil (pigmen hijau pada tanaman) dan heme (komponen penting dalam respirasi). Jadi, bisa dibilang ALA adalah bahan baku utama bagi fotosintesis dan respirasi tanaman.

Pada tanaman tingkat tinggi, ALA dibuat dari glutamat melalui proses tiga tahap di dalam stroma plastida (termasuk kloroplas, leukoplas, dan kromoplas). Jalur ini dikenal sebagai jalur C5. Sementara itu, pada hewan, jamur, dan beberapa bakteri, ALA terbentuk dari kondensasi succinyl-CoA dan glisin, yang dikatalisis oleh ALA sintase di mitokondria (jalur C4).

ALA sendiri bukanlah senyawa yang stabil. Ia bisa diubah menjadi serangkaian intermediet pirol seperti porfobilinogen (PBG), hidroksimetilbilan (HMB), uroporfirinogen III (URO III), dan akhirnya menjadi klorofil atau heme. Karena klorofil dan heme sangat penting untuk fotosintesis dan respirasi, ALA telah lama menjadi objek penelitian.

Namun, dalam beberapa dekade terakhir, para ilmuwan semakin tertarik pada potensi aplikasi ALA di bidang pertanian, kehutanan, dan hortikultura. Salah satu fungsi biologis ALA yang paling menarik adalah kemampuannya untuk mempromosikan pembukaan stomata.

Stomata: Gerbang Utama Fotosintesis

Stomata adalah "gerbang" masuknya CO2 dari atmosfer ke dalam sel mesofil daun. Di sinilah fotosintesis terjadi, mengubah energi matahari menjadi senyawa organik yang menyediakan energi dan materi bagi pertumbuhan dan perkembangan semua organisme, serta menjaga keseimbangan ekologi Bumi.

Sudah diketahui bahwa ALA dapat membalikkan penutupan stomata yang disebabkan oleh asam absisat (ABA), kondisi gelap, hidrogen peroksida (H2O2), dan kalsium (Ca2+). ALA juga dapat meningkatkan biosintesis dan transduksi sinyal etilen, menginduksi akumulasi flavonol, menghambat depolimerisasi mikrotubulus, dan menjaga asidifikasi sitosol, yang semuanya memfasilitasi pembukaan stomata.

Baru-baru ini, subunit katalitik serin/treonin protein fosfatase 2A (PP2A) telah diidentifikasi sebagai komponen penting dalam jalur sinyal ALA. PP2A bekerja dengan menghilangkan gugus fosfat dari MdSnRK2.6 yang diaktifkan oleh ABA. Selain itu, MdPTPA dan MdDGK3-like masing-masing berperan sebagai regulator positif dan negatif dalam jalur ALA-induced MdPP2AC untuk mempromosikan pembukaan stomata.

Ketika MdPTPA diekspresikan berlebihan pada tanaman tembakau transgenik, apertur stomata meningkat dengan kapasitas fotosintesis yang lebih tinggi, tetapi toleransi kekeringan menurun. Sebaliknya, ketika MdSnRK2.6 diekspresikan berlebihan, toleransi kekeringan meningkat, tetapi fotosintesis dan pertumbuhan tanaman terhambat. Menariknya, ketika MdPP2AC diekspresikan berlebihan, baik fotosintesis maupun toleransi kekeringan meningkat. Selain itu, perawatan dengan ALA eksogen meningkatkan pertumbuhan ketiga jenis genotip tanaman yang tumbuh di lingkungan dengan CO2 tinggi.

Dengan demikian, ALA dan molekul sinyal seperti PP2AC sangat penting bagi tanaman untuk mentoleransi tekanan lingkungan, melakukan fiksasi karbon fotosintetik, dan mendukung pertumbuhan tanaman. Namun, mekanisme bagaimana ALA mengatur pembukaan stomata masih belum sepenuhnya jelas.

Hubungan Antara ALA dan Metabolisme Pati

Pati adalah polimer glukosa kompleks yang merupakan produk utama asimilasi karbon fotosintetik. Pati disintesis di dalam kloroplas selama siang hari. Metabolisme pati memainkan berbagai peran dalam pertumbuhan dan perkembangan organ sumber (source organ), serta dalam mengurangi efek stres abiotik dan mengatur ritme stomata.

Secara fungsional, metabolisme pati dapat diklasifikasikan menjadi reaksi sintetik dan degradatif, yang keduanya dikatalisis oleh serangkaian enzim yang berbeda. Beta-amilase (BAM) adalah salah satu enzim vital yang memfasilitasi degradasi pati menjadi maltosa, sehingga mengontrol pertumbuhan dan perkembangan tanaman, merespons stres abiotik, dan mengatur pergerakan stomata.

Dalam Arabidopsis thaliana, sembilan anggota keluarga BAM dapat dibagi menjadi dua kategori berdasarkan aktivitas katalitiknya. AtBAM1/2/3/5/6 aktif secara enzimatis, di mana AtBAM1/2/3 dan AtBAM6 spesifik di kloroplas. AtBAM1 dan AtBAM3 menunjukkan fungsi spesifik tipe sel. AtBAM3 terutama bertanggung jawab atas aktivitas BAM utama untuk mendegradasi pati di mesofil daun, sedangkan AtBAM1 diekspresikan pada tingkat tinggi di sel penjaga dan memainkan peran utama dalam pemecahan pati yang cepat untuk melepaskan osmolit dan substrat pernapasan yang diperlukan untuk pembukaan stomata. Mutan bam1 knockout dapat mengakumulasi lebih banyak pati di sel penjaga, yang mengakibatkan penurunan apertur stomata. Sampai saat ini, efek degradasi pati yang dimediasi oleh BAM1 pada pergerakan stomata jarang dipelajari, kecuali pada Arabidopsis.

Kita tahu bahwa pati dalam sel penjaga daun Arabidopsis dapat diurai dalam waktu 30 menit di bawah cahaya untuk menghasilkan osmolit organik seperti gula terlarut dan asam organik, meningkatkan turgor sel penjaga, sehingga berkontribusi pada pembukaan stomata. Sebaliknya, ketika tanaman ditempatkan di tempat gelap, pati terakumulasi di sel penjaga, disertai dengan penutupan stomata. Proses degradasi/akumulasi pati ini diyakini sangat penting untuk kecepatan pergerakan stomata dan produksi biomassa.

Penelitian telah menunjukkan bahwa aplikasi ALA eksogen menyebabkan akumulasi gula dan pati di berbagai organ tanaman, termasuk di akar tunggang lobak, buah pir, stek ara, biji padi, dan buah persik. Namun, belum ada laporan sebelumnya tentang apakah ALA dapat mengatur metabolisme pati di sel penjaga untuk memengaruhi pergerakan stomata.

Penelitian Terbaru: ALA dan MdBAM17 pada Apel

Sebuah studi terbaru yang dilakukan pada tanaman apel (Malus × domestica) memberikan wawasan baru tentang bagaimana ALA mengatur pembukaan stomata. Penelitian ini menunjukkan bahwa ALA secara bersamaan menginduksi pemecahan pati di sel penjaga, meningkatkan aktivitas beta-amilase, dan membuka stomata pada daun apel.

Dengan menggabungkan identifikasi seluruh genom (GWI) dengan pengukuran apertur stomata, kandungan pati, aktivitas beta-amilase, manipulasi ekspresi gen, serta deteksi kadar flavonol dan H2O2 di sel penjaga, para peneliti menemukan bahwa MdBAM17 apel, gen ortolog dari AtBAM1, diperlukan untuk pemecahan pati yang diatur ALA di sel penjaga daun apel. MdBAM17 tampaknya bekerja hilir dari sinyal spesies oksigen reaktif (ROS), yang terlibat dalam pergerakan stomata yang diinduksi ALA. Penemuan ini memberikan wawasan baru untuk mengeksplorasi mekanisme pergerakan stomata yang diatur ALA, yang bermanfaat bagi aplikasi ALA dalam produksi hortikultura.

Bagaimana Penelitian Ini Dilakukan?

Untuk memahami bagaimana ALA memengaruhi stomata dan metabolisme pati, para peneliti melakukan serangkaian eksperimen yang cermat:

1. Pengukuran Apertur Stomata:
   • Epidermis daun apel dilepas dan direndam dalam larutan buffer dengan atau tanpa ALA.
   • Gambar stomata diambil menggunakan mikroskop, dan apertur stomata diukur dengan perangkat lunak khusus.
2. Pengujian Aktivitas Beta-Amilase:
   • Epidermis daun apel digiling menjadi bubuk, dan aktivitas beta-amilase ditentukan menggunakan kit khusus.
3. Kuantifikasi Pati di Sel Penjaga:
   • Dua metode digunakan untuk mengukur kadar pati: pewarnaan pseudo-Schiff propidium iodide (mPS-PI) dan pewarnaan iodin.
   • Pewarnaan mPS-PI melibatkan perendaman epidermis daun dalam larutan fiksatif, pembersihan dengan etanol, dan pewarnaan dengan asam periodat dan reagen Schiff dengan propidium iodida. Sinyal fluoresen dikumpulkan menggunakan mikroskop confocal laser scanning.
   • Pewarnaan iodin melibatkan dekolorisasi epidermis dalam etanol, diikuti dengan pewarnaan dengan larutan Lugol.
4. Analisis Bioinformatika Keluarga Gen BAM:
   • Dataset genom apel dan spesies Rosaceae lainnya diunduh dari basis data genom Rosaceae (GDR).
   • Anggota BAM dari AtBAMs dan OsBAMs diunduh dari TAIR dan situs web proyek anotasi genom padi.
   • Pencarian BLASTP lokal digunakan untuk mengidentifikasi anggota BAM dalam sepuluh spesies Rosaceae.
   • Kandidat diverifikasi menggunakan SMART untuk mengkonfirmasi keberadaan domain yang dilestarikan.
   • Pohon filogenetik dibuat menggunakan metode neighbor-joining (NJ) melalui perangkat lunak MEGA X.
5. Isolasi RNA dan Analisis qRT-PCR:
   • RNA total dari epidermis daun apel diisolasi menggunakan kit ekstraksi RNA tanaman.
   • Kit One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Supermix digunakan untuk mensintesis cDNA.
   • Ekspresi relatif dihitung dengan metode 2−ΔΔCT dan dinormalisasi oleh Md18S.
6. Uji Lokalisasi Subseluler:
   • CDS MdBAM17 dikloning ke dalam vektor pCAMBIA1302-35S:GFP.
   • Plasmida kosong dan rekombinan ditransformasikan ke dalam Agrobacterium tumefaciens strain GV3101.
   • Bakteri disuntikkan ke daun tembakau, dan fluoresensi protein fluoresen hijau (GFP) dan mCherry, atau autofluoresensi kloroplas, dideteksi menggunakan mikroskop confocal.
7. Uji Aktivitas Promotor:
   • Wilayah promotor yang terletak 2.000 bp hulu dari situs awal translasi (ATG) dari MdBAM17 diligasi ke dalam vektor pCAMBIA1300-35S:GFP dan pGreenII0800-LUC.
   • Plasmida kosong dan rekombinan ditransformasikan ke dalam A. tumefaciens GV3101 dan kemudian disuntikkan ke daun tembakau.
   • Sinyal GFP dipantau oleh mikroskop confocal, dan aktivitas luciferase (LUC) dideteksi oleh peralatan pencitraan langsung.
8. Ekspresi Transien MdBAM17 pada Daun Apel:
   • Untuk mengekspresikan berlebihan MdBAM17, panjang penuh CDS tanpa kodon stop diamplifikasi dan diligasi ke vektor pBI121 untuk menghasilkan plasmid rekombinasi fusi pBI121-MdBAM17-GUS.
   • Untuk mengganggu MdBAM17, fragmen spesifik dari CDS MdBAM17 dikloning dan direkombinasi ke vektor pHELLSGATE4 untuk membuat plasmid interferensi RNA (RNAi-MdBAM17).
   • Vektor kosong dan rekombinasi ditransformasikan ke dalam A. tumefaciens GV3101.
   • Solusi infeksi ditekan ke daun apel melalui metode infiltrasi vakum.
9. Penentuan Kadar Flavonol dan H2O2 pada Daun Apel Transgenik Transien:
   • Kandungan flavonol dan H2O2 di sel penjaga diukur menggunakan metode yang dijelaskan sebelumnya.
10. Analisis Data:
    • Data dianalisis menggunakan perangkat lunak SPSS dan Microsoft Excel. Perbedaan signifikan secara statistik ditentukan dengan analisis varians dua arah (ANOVA), diikuti oleh uji post hoc Tukey, dengan mempertimbangkan P < 0,05 sebagai signifikan.

Hasil Penelitian yang Menarik

Hasil penelitian ini mengungkapkan beberapa poin penting:

• ALA Meningkatkan Pembukaan Stomata: Perawatan dengan ALA secara signifikan meningkatkan pembukaan stomata pada daun apel yang terpapar cahaya.
• ALA Mempromosikan Degradasi Pati: ALA mendorong pemecahan pati di sel penjaga daun apel.
• MdBAM17 adalah Kunci: Gen MdBAM17, ortolog dari AtBAM1 di Arabidopsis, diperlukan untuk pemecahan pati yang diatur ALA di sel penjaga daun apel.
• MdBAM17 Terlokalisasi di Kloroplas: MdBAM17 ditemukan berada di kloroplas, tempat pati disintesis dan didegradasi.
• Aktivitas Promotor MdBAM17 Ditingkatkan oleh ALA: ALA meningkatkan aktivitas promotor MdBAM17, yang berarti ALA meningkatkan ekspresi gen ini.
• Ekspresi MdBAM17 Mempengaruhi Stomata: Ekspresi MdBAM17 memengaruhi degradasi pati dan pergerakan stomata yang diatur ALA.

Implikasi Penelitian Ini

Penelitian ini memberikan wawasan baru tentang bagaimana ALA mengatur pembukaan stomata pada tanaman. Dengan memahami peran MdBAM17 dan metabolisme pati, kita dapat mengembangkan strategi baru untuk meningkatkan fotosintesis dan pertumbuhan tanaman, terutama dalam kondisi lingkungan yang kurang ideal.

Misalnya, aplikasi ALA dapat membantu tanaman membuka stomata mereka lebih lebar, memungkinkan lebih banyak CO2 masuk untuk fotosintesis. Ini dapat meningkatkan hasil panen dan membuat tanaman lebih tahan terhadap stres lingkungan seperti kekeringan dan suhu tinggi.

Kesimpulan

ALA memainkan peran penting dalam mengatur pembukaan stomata dan metabolisme pati pada tanaman. Gen MdBAM17 tampaknya menjadi kunci dalam proses ini. Dengan terus meneliti mekanisme ini, kita dapat membuka potensi penuh tanaman untuk menghasilkan makanan dan energi secara berkelanjutan.

Jadi, lain kali Kamu melihat tanaman hijau yang subur, ingatlah bahwa ada dunia biokimia yang kompleks terjadi di dalam daunnya. Dan ALA, bersama dengan metabolisme pati yang diatur dengan cermat, adalah bagian penting dari cerita itu.

Sumber: Horticultural Plant Journal